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5 保溫孵育
5.1 在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加酶結(jié)合物和加底物后�？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫育，保溫過程按照說明書要求，一般為常溫(20~25℃)溫育，可根據(jù)室溫適當(dāng)調(diào)節(jié)保溫時(shí)間。
5.2 在孵育期間，如果工作臺溫度過低，應(yīng)適當(dāng)鋪墊紙巾或其他材料。
5.3 孵育時(shí)間的計(jì)算越規(guī)范越好，保持添加標(biāo)準(zhǔn)品的一致性，先添加標(biāo)準(zhǔn)品后再添加樣品，有利于檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
6 洗板
6.1 ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)�？梢哉f在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌，不得馬虎。
6.2 洗板時(shí)尤其是將孔內(nèi)液體甩干時(shí)，動作要快、要干凈利落，要把整板垂直倒置，將液體甩出，防止各孔液體混流，最后在吸水紙上拍干，不可甩干。此種方法可有效避免試劑盒孔的交叉污染。
6.3 洗板次數(shù)和兩次洗板間隔時(shí)間應(yīng)盡量按照說明書進(jìn)行。
7 顯色
7.1 顯色是ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。
7.2 在定量測定中，加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。
7.3 定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行，時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制，有時(shí)可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時(shí)間，及時(shí)判斷。
8 測定
8.1 對定量判定應(yīng)繪制半對數(shù)曲線，從曲線上讀出樣品對應(yīng)濃度值。本實(shí)驗(yàn)室酶標(biāo)儀通過吸光度可直接得出濃度值，再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)即為樣品中克倫特羅的實(shí)際濃度值。
8.2 對于每次實(shí)驗(yàn)濃度值的準(zhǔn)確性判定可觀察標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度值是否為線性關(guān)系，即吸光度值是否呈梯度遞減。當(dāng)吸光度值無明顯梯度時(shí)應(yīng)考慮重新檢測。因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)檢測不準(zhǔn)確，機(jī)器依照標(biāo)準(zhǔn)檢出的數(shù)據(jù)也會不準(zhǔn)確。
8.3 當(dāng)板間差異性大時(shí)，可能原因是板與板之間孵育時(shí)間相差太大，板與板之間洗滌不一致，移液槍使用不當(dāng)，溫度不同等。
只要操作者嚴(yán)格按照步驟進(jìn)行，并且每項(xiàng)操作都認(rèn)真、仔細(xì)，尤其注重細(xì)節(jié)的操作，克倫特羅ELISA快速檢測試劑盒的準(zhǔn)確性也相對較高，較適合實(shí)驗(yàn)室大批樣品的檢測需要。
