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背 景
1）低蛋白日糧的精髓在于降低蛋白保持氨基酸高水平不降低。
2）降蛋白的同時(shí)讓我們越來越多的關(guān)注更多種氨基酸的平衡。
3）隨著氨基酸工業(yè)化的發(fā)展，晶體氨基酸的添加成本在降低，能夠在飼料中添加的氨基酸品種越來越來越多。
4）支鏈氨基酸（branched chain amino acids,BCAAs）（包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）功效一再被證實(shí)，正在被廣泛應(yīng)用。
目 的
研究低蛋白日糧添加BCAA對仔豬生長性能、采食量及肌肉重量的影響。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
選擇33日齡斷奶、體重（8.45±0.62kg）相近的長Х大二元雜交閹割公豬28頭，代謝籠單籠飼養(yǎng)。隨機(jī)分為四組，分別為正對照組PC（高蛋白日糧組),負(fù)對照組NC（降蛋白不補(bǔ)充Leu、Ile、Val ),實(shí)驗(yàn)1組T1（補(bǔ)充Leu、Ile、Val達(dá)到正對照組水平），實(shí)驗(yàn)2組T2（添加Leu、Ile、Val的量是實(shí)驗(yàn)1組的2倍）
表1 試驗(yàn)日糧的組成（%）
表2 試驗(yàn)日糧的營養(yǎng)成分
結(jié) 果
與負(fù)對照相比，添加BCAAs的T1組T2組顯著提高了日增重，日均采食量、肉料比(P＜0.05）。且與正對照組相比在日增重、日均采食量、肉料比均無差異。如圖1
圖1：低蛋白日糧添加BCAAs對仔豬生長性能的影響
與正對照組相比，低蛋白日糧的負(fù)對照組和試驗(yàn)1組均顯著降低了糞氮、尿氮和總氮的排放（P＜0.05），試驗(yàn)2組顯著降低了尿氮和總氮的排放（P＜0.05）。與負(fù)對照相比，添加BCAAs的T1組和T2組均顯著提高了氮沉積，并能夠恢復(fù)正對照水平。如圖2
圖2：低蛋白日糧添加BCAAs對仔豬氮平衡的影響
正對照組宰前活重顯著高于負(fù)對照組（P＜0.05），其他胴體性狀指標(biāo)在數(shù)值上高于負(fù)對照組，未達(dá)到顯著水平。與負(fù)對照組相比，添加BCAAs的T1組和T2組均顯著提高了宰前活重、左半胴體重、眼肌面積、前、中和后驅(qū)肌肉重以及肌肉總重（P＜0.05）。如表3
表3：低蛋白日糧添加BCAAs對仔豬胴體性狀的影響
結(jié) 論
低蛋白日糧（CP 為 17%）添加 BCAAs 可以提高采食量以及直接促進(jìn)肌肉生長，從而改善仔豬生長性能及日糧氮沉積，并能恢復(fù)到飼喂 CP 為20%日糧的水平。
參考文獻(xiàn)： 鄭溜豐.低蛋白日糧添加支鏈氨基酸對仔豬采食量和骨骼生長的影響及調(diào)控機(jī)制研究:[博士學(xué)位論文]. 武漢.華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017
《低蛋白日糧添加支鏈氨基酸對仔豬采食量和骨骼生長的影響及調(diào)控機(jī)制研究》
【作 者】鄭溜豐
【學(xué)位授予單位】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位名稱】博士
【導(dǎo)師姓名】彭健
【學(xué)位年度】2017
【關(guān)鍵詞】仔豬；低蛋白日糧；支鏈氨基酸；采食量；骨骼肌生長；蛋白質(zhì)合成與降解；氨基酸代謝
【摘 要】
充足的底物濃度和平衡的氨基酸模式是豬骨骼肌高效蛋白質(zhì)合成的必要條件。其中,采食量是保障充足的底物濃度的關(guān)鍵。除作為合成蛋白質(zhì)底物外,支鏈氨基酸（branched chain amino acids,BCAAs）（包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）可能還發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控作用。比如,纈氨酸能夠調(diào)控豬采食量。此外,幾乎所有谷氨酸和天冬氨酸以及大部分谷氨酰胺在腸道發(fā)生了分解代謝,導(dǎo)致不可逆的損失。骨骼肌蛋白質(zhì)合成所需的這三個(gè)非必需氨基酸必須要由BCAAs代謝生成。而且BCAAs僅有部分被腸道和肝臟等器官截留。因此,通過日糧中添加BCAAs可能增加骨骼肌內(nèi)自身代謝生成谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸,優(yōu)化胞內(nèi)氨基酸模式,促進(jìn)蛋白質(zhì)合成。目前已有的研究表明,日糧添加BCAAs可以提高豬生長性能,但其對采食量及骨骼肌蛋白質(zhì)沉積的調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。
本研究圍繞BCAAs提高仔豬采食及骨骼肌生長的關(guān)鍵問題,通過兩輪仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)證實(shí)了低蛋白日糧添加BCAAs通過提高采食量和直接促進(jìn)肌肉生長,改善仔豬生長性能,并進(jìn)一步闡明了下丘腦感應(yīng)BCAAs調(diào)節(jié)仔豬采食量的機(jī)制。應(yīng)用血插管結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù),研究了日糧BCAAs對攝食狀態(tài)下骨骼肌的氨基酸凈利用及代謝的影響,并探究了BCAAs代謝與肌肉氨基酸凈利用的關(guān)系;應(yīng)用血插管結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù),進(jìn)一步闡明了BCAAs通過自身代謝調(diào)控骨骼肌蛋白質(zhì)合成的機(jī)制。最后研究了日糧BCAAs對禁食狀態(tài)下骨骼肌內(nèi)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與降解的信號通路活性的影響。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
第一部分:通過兩輪仔豬飼養(yǎng)試驗(yàn)研究了低蛋白日糧添加BCAAs對仔豬生長性能、采食量及骨骼肌生長的影響。
在試驗(yàn)一中,選取28頭斷奶仔豬分為4個(gè)組,即正對照組、負(fù)對照組、試驗(yàn)1組以及試驗(yàn)2組,日糧粗蛋白水平依次為19.5%、16.7%、16.7%和17.2%。其中,試驗(yàn)1組在負(fù)對照組基礎(chǔ)上添加纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸保證日糧中三種BCAAs水平與正對照組一致,并增加一倍的添加劑量形成試驗(yàn)2組的日糧。自由采食。
試驗(yàn)二為配對試驗(yàn),選取21頭斷奶仔豬分為3個(gè)組,即負(fù)對照組、試驗(yàn)1組以及配對組。其中,負(fù)對照組和試驗(yàn)1組同試驗(yàn)一。配對組試豬飼喂試驗(yàn)1組的日糧,但采食量與負(fù)對照組保持一致。28 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,每組隨機(jī)選擇6頭屠宰,測定胴體性狀,采集下丘腦及背最長肌樣。同時(shí),剝離背最長肌等主要的23塊肌肉,分別稱量肌肉塊重量。
主要結(jié)果如下:
1.與負(fù)對照組相比,試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組顯著提高了平均日增重、末重、采食量、前軀、中軀和后軀肌肉總重、背最長肌等大多數(shù)肌肉塊重量以及氮沉積（P<0.05）,并能恢復(fù)到正對照組的水平。當(dāng)采食量保持一致時(shí),添加BCAAs的配對組仍能顯著提高仔豬平均日增重和肉料比（P<0.05）,并也顯著提高了岡上肌、背闊肌、背最長肌等大塊肌肉重量（P<0.05）。
2.與負(fù)對照組相比,日糧添加BCAAs以劑量依賴的方式上調(diào)下丘腦Agrp和NPY mRNA水平,下調(diào)MC4R mRNA水平,并在試驗(yàn)2組達(dá)到差異顯著水平（P<0.05）。此外,試驗(yàn)1組顯著下調(diào)了CART mRNA水平（P<0.05）�；貧w分析顯示,采食量隨NPY mRNA水平增加呈二次曲線增加（P=0.02）,而隨MC4R mRNA水平增加呈線性降低（P=0.02）。表明日糧添加BCAAs對采食量的提高與其上調(diào)下丘腦NPY基因表達(dá)以及下調(diào)MC4R基因表達(dá)有關(guān)。
3.與負(fù)對照組相比,試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組顯著降低了下丘腦eIF2α磷酸化水平,以及顯著提高了S6K1磷酸化水平（P<0.05）,并能恢復(fù)到正對照組的水平。此外,試驗(yàn)1組的mTOR磷酸化水平顯著高于負(fù)對照組（P<0.05）。表明日糧添加BCAAs對采食量的提高與其降低GAAC通路活性以及提高mTORC1通路活性有關(guān)。
4.與負(fù)對照組相比,試驗(yàn)1組和配對組均顯著提高了背最長肌S6K1和mTOR磷酸化水平（P<0.05）,但試驗(yàn)1組和配對組之間差異不顯著。說明BCAAs能夠激活骨骼肌mTORC1通路活性,且不依賴于采食量的變化。
第二部分:利用血插管結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)研究了日糧添加BCAAs對仔豬肌肉氨基酸凈利用和股靜脈代謝產(chǎn)物譜的影響。試驗(yàn)動物同第一部分的配對試驗(yàn)。28 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后,對負(fù)對照組及試驗(yàn)1組的試豬分別在股動脈、股靜脈、頸動脈和頸靜脈安裝插管。在術(shù)后的第5 d,每組各選擇6頭健康且插管通暢的試豬進(jìn)行正式試驗(yàn)。通過股動脈持續(xù)9 h灌注對氨基馬尿酸（pAH）以測定肌肉血流速度。每隔1 h飼喂以保持試豬始終處于攝食狀態(tài),連續(xù)飼喂8次。攝食前及攝食后每隔1 h分別采集頸動脈和股靜脈血樣以供分析pAH、游離氨基酸及支鏈α酮酸,連續(xù)采集8次。待血樣采集完成后屠宰,采集股二頭肌樣用于游離氨基酸及3-甲基組氨酸分析,股靜脈血樣同時(shí)進(jìn)行代謝組學(xué)分析。
主要結(jié)果如下:
1.肌肉血流速度在攝食后顯著提高了（P<0.05）,但不受日糧處理的影響。日糧添加BCAAs顯著增加了動脈和肌肉游離的異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸濃度（P<0.05）,但顯著降低了動脈游離的苯丙氨酸和絲氨酸濃度以及肌肉游離的絲氨酸濃度（P<0.05）。同時(shí),添加BCAAs顯著降低了肌肉游離的3-甲基組氨酸濃度（P<0.05）,表明BCAAs抑制骨骼肌蛋白質(zhì)動員。
2.日糧添加BCAAs顯著提高了總BCAAs、總必需氨基酸、總非必需氨基酸及總氨基酸的肌肉凈利用量（P<0.05）,從而維持高效的蛋白質(zhì)沉積。此外,添加BCAAs顯著增加了異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸及其代謝產(chǎn)物丙氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺的肌肉凈利用量（P<0.05）,同時(shí)還顯著增加了組氨酸、蛋氨酸以及甘氨酸、脯氨酸和絲氨酸等功能性非必需氨基酸的肌肉凈利用量（P<0.05）。
3.日糧添加BCAAs對股靜脈代謝物有顯著影響,這些差異化合物與BCAAs代謝和蛋白質(zhì)合成相關(guān)。例如,添加BCAAs顯著提高了三種支鏈α酮酸、谷氨酰胺以及天冬酰胺等代謝產(chǎn)物含量（P<0.05）;同時(shí)也顯著提高了二十碳五烯酸等脂質(zhì)代謝相關(guān)產(chǎn)物含量（P<0.05）。進(jìn)一步對產(chǎn)物定量的結(jié)果顯示,添加BCAAs顯著提高了KIC和KMV（分別為亮氨酸和異亮氨酸的轉(zhuǎn)氨產(chǎn)物）的肌肉凈生成量（P<0.05）,提示添加BCAAs增加了骨骼肌內(nèi)自身的代謝。
4.肌肉氨基酸凈利用量分別與動脈的亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸濃度呈顯著正相關(guān)（P<0.05）,而與肌肉的BCAAs濃度之間無相關(guān)性。有趣的是,肌肉氨基酸凈利用量分別與KIC和KMV凈生成量呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。這些結(jié)果暗示添加BCAAs可能通過增加動脈濃度及胞內(nèi)自身代謝來提高肌肉氨基酸凈利用量。
第三部分:利用血插管結(jié)合穩(wěn)定同位素示蹤技術(shù)研究了日糧BCAAs通過調(diào)控自身代謝影響仔豬骨骼肌蛋白質(zhì)合成與降解的機(jī)制。攝食狀態(tài)下機(jī)制研究的試驗(yàn)動物同第二部分試驗(yàn)。在試豬第一次采食完,通過頸靜脈灌注NaH13CO3,持續(xù)2 h。隨后灌注[1-13C]亮氨酸,持續(xù)6 h。pAH灌注以及血樣采集同第二部分試驗(yàn)。血樣用于分析亮氨酸、KIC和CO2濃度及其同位素豐度。禁食狀態(tài)下機(jī)制研究的試驗(yàn)動物同第一部分試驗(yàn)的試驗(yàn)一。采集負(fù)對照組和試驗(yàn)1組的背最長肌樣。
主要結(jié)果如下:
1.日糧添加BCAAs顯著提高亮氨酸的動脈攝入量和凈利用量（P<0.05）,從而顯著提高蛋白質(zhì)合成量以及沉積量（P<0.05）。添加BCAAs也顯著增加凈轉(zhuǎn)氨量（P<0.05）,但不影響氧化脫羧量。有趣的是,蛋白質(zhì)降解在添加BCAAs后亦顯著增加了（P<0.05）。進(jìn)一步的代謝命運(yùn)分析顯示,肌肉攝取亮氨酸約有30%發(fā)生代謝,并主要經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用生成KIC。
2.肌肉的[1-13C]亮氨酸凈攝取以及[1-13C]KIC凈生成在日糧添加BCAAs后也顯著提高了（P<0.05）。相關(guān)分析顯示,骨骼肌蛋白質(zhì)合成分別與蛋白質(zhì)降解及[1-13C]KIC凈生成之間呈顯著正相關(guān)（P<0.05）,暗示日糧BCAAs可能通過增加蛋白質(zhì)降解以及自身的轉(zhuǎn)氨代謝,提高攝食狀態(tài)下蛋白質(zhì)合成。
3.日糧添加BCAAs顯著提高了背最長肌的Akt、mTOR及其下游靶蛋白S6K1的磷酸化水平（P<0.05）,提示飼喂BCAAs仔豬在禁食狀態(tài)下骨骼肌具有更高的蛋白質(zhì)合成能力。此外,添加BCAAs顯著增加了FoxO1磷酸化水平（P<0.05）,相應(yīng)地下調(diào)了Atrogin-1、MuRF1以及LC3-II蛋白的表達(dá)（P<0.05）,提示飼喂BCAAs仔豬在禁食狀態(tài)下骨骼肌呈現(xiàn)更低水平的蛋白質(zhì)降解。
本研究的主要結(jié)論為:
（1）低蛋白日糧添加BCAAs可以提高采食量以及直接促進(jìn)肌肉生長,從而改善仔豬生長性能,并能恢復(fù)到飼喂高蛋白日糧的水平;
（2）日糧BCAAs可以通過影響下丘腦的食欲調(diào)節(jié)基因表達(dá)及通路活性,提高采食量;
（3）日糧BCAAs通過促進(jìn)自身在肌細(xì)胞內(nèi)的代謝以及蛋白質(zhì)降解,進(jìn)而增加氨基酸凈利用量,提高攝食狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)合成速率;同時(shí),日糧BCAAs通過下調(diào)泛素-蛋白酶體以及自噬-溶酶體途徑的關(guān)鍵蛋白表達(dá),抑制禁食狀態(tài)下骨骼肌蛋白質(zhì)降解,并最終提高蛋白質(zhì)沉積,從而促進(jìn)骨骼肌生長。
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