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尼帕病毒病(NVD) 是由尼帕病毒引起的一種新的人畜共患病毒性疾病，于1997 年在馬來(lái)西亞森美蘭洲雙溪尼帕城首次發(fā)現(xiàn)，是繼瘋牛病、口蹄疫、禽流感后又一引起世界各國(guó)廣泛關(guān)注和恐慌的人畜共患病。生豬感染該病毒后，出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸困難及腦炎癥狀;母豬感染該病毒后表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀，可能會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)或突然死亡;人感染該病毒后發(fā)生病毒性腦炎而死亡。由于其引起人感染后的高死亡率，缺乏有效的疫苗和治療方法，因此世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE) 和我國(guó)農(nóng)業(yè)部都將其列為生物安全4 級(jí)病原體。
1、概況
尼帕病毒病是由副黏病毒科亨尼帕病毒屬(Henipavi rus) 的尼帕病毒(NiV) 引起的一種人畜共患傳染病。NiV是新發(fā)現(xiàn)于蝙蝠的一種副黏病毒，1999 年3 月初， 從Sungai Nipah 村1名腦炎患者的腦脊液中分離到了一種新的副黏病毒，并確定為該次暴發(fā)的病原，因此命名為尼帕病毒(Nipah virus)。血清學(xué)檢測(cè)顯示，家養(yǎng)動(dòng)物如狗、貓、馬和山羊均可感染尼帕病毒，但豬是其他家養(yǎng)動(dòng)物的傳染源。尼帕病毒可感染不同年齡的豬，從1998 年馬來(lái)西亞暴發(fā)尼帕病毒病以來(lái)，已造成許多人和豬傷亡，引起了巨大的社會(huì)恐慌，并給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
2、實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)
2.1 病原學(xué)檢測(cè)
2.1.1 NiV 分離鑒定
NiV 能夠在多種培養(yǎng)細(xì)胞中生長(zhǎng)并快速增殖至較高的滴度。非洲綠猴腎細(xì)胞和兔腎細(xì)胞RK-13 細(xì)胞系對(duì)NiV 尤為敏感。通常在病毒感染3 d 內(nèi)能夠觀察到病毒病變效應(yīng)(CPE)，但一般來(lái)說(shuō)在細(xì)胞上傳代2 次，每次5 d 所達(dá)到的分離效果更為穩(wěn)定。經(jīng)低毒量穩(wěn)定傳代后的病毒再次感染細(xì)胞后24 ～ 48 h，細(xì)胞出現(xiàn)以形成合胞體為特征的CPE，并且感染早期，合胞體中所有細(xì)胞核位于合胞體中央，而晚期則被運(yùn)送至合胞體外，并聚集在其周圍。由于NiV 在體外細(xì)胞培養(yǎng)中擴(kuò)增迅速，并且能產(chǎn)生大量的病毒抗原，所以采用免疫熒光或免疫電鏡法檢測(cè)分離培養(yǎng)該病毒，最為方便快速。
2.1.2 分子診斷技術(shù)
NiV 的基因組全序列已被測(cè)出，研究者們可以在此基礎(chǔ)上針對(duì)NiV 的分子診斷技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)的研發(fā)。目前，已經(jīng)被報(bào)道的針對(duì)NiV 的分子檢測(cè)技術(shù)有2 種，分別為熒光定量RT-PCR和雙重套式RT-PCR。
2.1.2.1 熒光定量RT-PCR
該方法敏感度高、特異性強(qiáng)，并且不需要接觸活的感染性病毒，具有生物安全性的優(yōu)勢(shì)。其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到 1 個(gè)空斑形成單位( PFU)，并且有被學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)可的相關(guān)引物和探針有：
5′-TCAGCAGGAAGGCAAGAGAGTAA-3′(Primer1)，
5′-CCCCTTCATCGATATCTTGATCA-3′(Primer2)，
5′-6FAM-CCTCCAATGAGCACACCTCCTGCAGTAMRA-3 ′(TaqMan probe)，為NiV 的實(shí)驗(yàn)室快速診斷提供了技術(shù)支持。
2.1.2.2 雙重套式RT-PCR ：
Wacharapluesadee 等描述了一種帶有內(nèi)參的雙重套式RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)能夠用于對(duì)果蝠尿樣的檢測(cè)，并且加入內(nèi)參大大降低PCR 相關(guān)的抑制因素帶來(lái)的假陰性的結(jié)果，提高檢出準(zhǔn)確率，在NiV 流行病學(xué)調(diào)查時(shí)大大提高NiV 監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性。
2.1.3 其他診斷技術(shù)
主要針對(duì)NiV 全病毒抗原或病毒主要致病抗原(如F 蛋白和G 蛋白等)制備特異性的病毒抗血清或單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立病毒中和試驗(yàn)、免疫組化以及免疫熒光等方法檢測(cè)NiV相關(guān)抗原。病毒中和試驗(yàn)主要包括傳統(tǒng)的空斑抑制試驗(yàn)、微孔板中和試驗(yàn)以及免疫空斑試驗(yàn)3種，分別通過(guò)計(jì)算空斑形成單位(PFU)、組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)以及病灶形成單位(FFU)達(dá)到檢測(cè)病毒抗原或抗體的目的。檢測(cè)NiV 的病毒中和試驗(yàn)需要在BSL4 級(jí)生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，但近年來(lái)研究者們陸續(xù)開(kāi)發(fā)了幾種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，能夠?qū)z測(cè)NiV的生物安全水平降低至BSL2 級(jí)，為偏遠(yuǎn)地區(qū)NiV 檢測(cè)提供了幫助。由于NiV 原發(fā)于血管內(nèi)壁，所以病死畜的多個(gè)器官均可用于免疫組化的檢測(cè)，尤其是肺臟。
目前，研究者們已經(jīng)針對(duì)NiV 的免疫組化法檢測(cè)研發(fā)了幾個(gè)檢測(cè)體系，為該病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)提供了技術(shù)支持。
2.2 血清學(xué)檢測(cè)
鑒于NiV 的生物危害性，用于該病毒血清學(xué)診斷的所有血清樣品必需進(jìn)行安全化處理，以盡量減少實(shí)驗(yàn)室工作人員接觸NiV 的風(fēng)險(xiǎn)�？梢杂�6 kGy的γ 射線輻照或含0.05% Tween20和0.5% Triton—X100 PBS(磷酸緩沖液) 1/5 稀釋后56 ℃ 30 min 滅活的方法對(duì)血清樣品進(jìn)行前處理。目前常用的NiV 的血清學(xué)檢測(cè)方法包括病毒中和試驗(yàn)和ELISA 試驗(yàn)。
2.2.1 病毒中和試驗(yàn)
目前針對(duì)NiV 抗體檢測(cè)的病毒中和試驗(yàn)已經(jīng)有相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法，Kaku等人利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了共表達(dá)NiV F 或G 蛋白與綠色熒光蛋白(GFP)的重組水泡性口炎病毒，作為已知病毒抗原檢測(cè)NiV 血清樣本，用該重組病毒作為已知病毒抗原的好處在于GFP是可見(jiàn)的，可以在熒光顯微鏡下直觀地?cái)?shù)出熒光斑點(diǎn)的數(shù)量而獲知血清樣品中NiV 特異性抗體的含量。該方法要比傳統(tǒng)的中和試驗(yàn)更為迅速、安全和靈敏。Tamin 同樣也利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了單獨(dú)表達(dá)F 或G 蛋白的重組水泡性口炎病毒作為已知抗原，檢測(cè)NiV 抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)NiV 抗體的空斑抑制試驗(yàn)。
2.2.2 ELISA
目前， 針對(duì)NiV 抗體檢測(cè)的ELISA 技術(shù)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出間接ELISA 和捕獲ELISA 2 種。Daniels 在1999年召開(kāi)的國(guó)際豬病監(jiān)測(cè)會(huì)議中提出了一種用非離子去污劑處理NiV 感染的細(xì)胞以獲得ELISA 檢測(cè)用NiV 抗原的方法，隨后，為消除ELISA 的非特異性，研究者們又在此基礎(chǔ)上加入了非感染細(xì)胞作為對(duì)照。美國(guó)疾病控制中心開(kāi)發(fā)出能夠檢測(cè)針對(duì)NiV IgG 和IgM 2 種亞型免疫球蛋白的ELISA 技術(shù)。此外，Yu 等人也報(bào)道過(guò)用NiV N 蛋白作為病毒抗原檢測(cè)IgG 和IgM 2 種亞型免疫球蛋白的ELISA 方法。
3、防控措施
目前對(duì)該病尚無(wú)有效的藥物和治療方法，只能采取強(qiáng)制措施，監(jiān)測(cè)并淘汰患病動(dòng)物，以免傳染給人;防止家豬與野豬的接觸;禁止運(yùn)輸和進(jìn)口患病豬及其肉制品;對(duì)豬舍進(jìn)行消毒，搞好清潔衛(wèi)生工作。人感染后，用廣譜抗病毒藥Ribavirin( 利巴韋林)，可減少發(fā)燒時(shí)間，緩解發(fā)病程度，降低急性腦炎死亡率。隨著科學(xué)家對(duì)這一病原的不斷了解，人們利用皰疹病毒為載體進(jìn)行F、G 融合蛋白克隆，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，有可能用來(lái)防治尼帕病毒的感染，其他相關(guān)的疫苗正在研究開(kāi)發(fā)中。
